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產(chǎn)品說(shuō)明
UDG酶可催化水解含有尿嘧啶的 DNA鏈的尿嘧啶堿基和核糖磷酸骨架間的N-糖苷鍵，釋放游離尿嘧啶。本尿嘧啶 DNA糖苷酶（UDG）來(lái)源于海洋低溫細(xì)菌udg基因，經(jīng)重組表達(dá)與多步蛋白純化而得。該酶分子量為 25KDa，催化含尿嘧啶的單鏈和雙鏈 DNA釋放游離尿嘧啶，對(duì) RNA無(wú)活性。
UDG酶常用于防止 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染，其作用原理基于：在 PCR反應(yīng)中以 dUTP替代dTTP摻入 DNA中，形成了含 dU堿基的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，UDG能選擇性斷裂單鏈和雙鏈 DNA 中 U堿基的糖苷鍵，降解 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，消除上輪擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)新樣本的污染問(wèn)題。
本公司的熱敏 UDG在20-40度均具有較高活性，在50-55度失活，非常適合用于防止 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染。由于大腸桿菌 UDG經(jīng)高溫失活，降溫到低溫后，活性會(huì)部分恢復(fù)；因此不建議利用大腸桿菌UDG酶進(jìn)行防止 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染。
本公司熱敏UDG是重組表達(dá)，并經(jīng)多步純化制備的重組蛋白。
活性定義
32℃反應(yīng)條件下，每分鐘催化 60 pmole尿嘧啶堿基從含尿嘧啶的雙鏈 DNA（dU/dA）上釋放所需要的酶量為1 U。
活性測(cè)定條件
Taq PCR Buffer：10 mM Tris-HCl (pH 8.3, 25°C)，20 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4，0.01% Tween 20，1.5 mM MgCl2 中，37度溫育。
濃度：1U/μl
保存條件：-20℃保存
特點(diǎn)：
? 20-40度均具有較高活性，避免了極端熱敏UDG常溫失活的缺陷；
? 在50度開(kāi)始失活，55度處理10分鐘失活90%，60℃處理10分鐘，完全不可逆失活。即保證了低溫和常溫具有高活性，又保證了中高溫快速失活。
? 非常適合用于防止PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染
? 本酶的反應(yīng)體系與 Taq DNA聚合酶 buffer相同，保證了活性體系的一致性。
適用范圍
? 防止PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染的極佳優(yōu)選酶。
產(chǎn)品包裝規(guī)格及組成
Component | AE1102A | AE1102B |
UDG | 200U | 1000U |
10×UDG Buffer | 0.5 ml | 1.5 ml |
質(zhì)量控制
無(wú)內(nèi)切酶活性：50 U 的本酶和1 μg的 pBR322 DNA 在 37℃下反應(yīng) 2 小時(shí)，DNA 的電泳譜帶不發(fā)生變化。
酶貯存緩沖液
20mM Tris-HCl (pH7.5),100mMNaCl, 1mMEDTA, 1mMDTT, 0.05%Tween20,50% glycerol。
相關(guān)產(chǎn)品
AE0101: Taq DNA Polymerase
應(yīng)用舉例
防止PCR產(chǎn)物污染的使用方法
1. 按如下表格配制PCR反應(yīng)液
PCR 組份 | 體積/μl | 終濃度 |
10×Taq 酶 Buffer | 5 | 1× |
dNTPs（2.0 mM） | 5 | 0.2 mM |
dUTP（2.0 mM） | 1-5 | 0.04-0.2 mM |
引物F（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
引物R（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
Template | 1-5 | / |
熱啟動(dòng) Taq 聚合酶（5U/μl） | 0.5 | 2.5U |
熱敏UDG（1U/μl） | 1 | 1U |
ddH2O | Variable | / |
總體積 | 50 | / |
2. 30-37℃下反應(yīng)10分鐘。
3. PCR反應(yīng)。
警告: 本產(chǎn)品僅限科研實(shí)驗(yàn)使用，臨床應(yīng)用安全性和有效性未鑒定，不可用于醫(yī)療臨床診斷。
注意事項(xiàng)
1. 本公司熱敏UDG酶的反應(yīng)溫度可以在 20℃－45℃ 的范圍內(nèi)變化，建議在 25-37度反應(yīng)。
2. UDG切割含dU堿基的ssDNA活性最高，大概是dU/dA雙鏈DNA的5-10倍，各種底物的活性順序?yàn)椋篸U/dA < dU/dG < dU/dC ≈ dU/dT < ssDNA。
3. 長(zhǎng)期儲(chǔ)存 (非頻繁使用; 每月 1-2次 ): -70℃；每天或每周使用: -20℃。盡量避免多次凍融，切勿暴露在溫度波動(dòng)較大之處。溫度波動(dòng)對(duì)產(chǎn)品的穩(wěn)定性有極大影響。
4. UDG可以在 PCR反應(yīng)前清除不慎污染的 U-DNA分子，對(duì)于某個(gè)DNA片段的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，整個(gè)操作室必須在所有操作批次的 PCR反應(yīng)中添加 dUTP，使所有擴(kuò)增產(chǎn)物都成為 U-DNA。如果僅某次 PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用 dUTP，T-DNA仍積累，這個(gè)抗污染系統(tǒng)也難以起到完全的作用。
5. UDG/dUTP系統(tǒng)是 PCR試劑專用的一種防污染措施，為了防止 PCR產(chǎn)物的污染，尤其是在臨檢實(shí)驗(yàn)室中反復(fù)擴(kuò)增同一片段時(shí)，必須嚴(yán)格規(guī)范實(shí)驗(yàn)室的區(qū)域劃分和操作。
6. 如果經(jīng)過(guò)換房間、紫外照射、DNase消化等措施后，依然對(duì)某個(gè)片段存在污染，建議在不同的擴(kuò)增區(qū)重新設(shè)計(jì)引物，以錯(cuò)開(kāi)污染片段。
