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產品說明
尿嘧啶DNA糖苷酶(Uracil N-Glycosylase，UNG)又名Uracil-DNA Glycosylase（UDG）, 為來源于E. coli ung基因的重組表達蛋白，分子量為26kDa。它可催化含尿嘧啶的單鏈和雙鏈DNA（長度大于6個堿基）釋放游離尿嘧啶，但對RNA無活性。 UNG主要應用于PCR擴增產物的防污染，作用原理為：如果在PCR反應中以dUTP替代dTTP摻入DNA中，形成了含dU堿基的PCR擴增產物，該酶能選擇性斷裂單鏈和雙鏈DNA中U基的糖苷鍵，降解該PCR擴增產物。
由于大腸桿菌 UDG經高溫失活，降溫到低溫后，活性會部分恢復；因此不建議將本酶用于防止 PCR擴增產物的交叉污染。建議利用本公司的熱敏 UDG（目錄號 AE1102）進行防止 PCR擴增產物的交叉污染。
本公司Ec UDG是重組表達，并經多步純化制備的重組蛋白。
單位定義
一個活性單位為每分鐘從含有尿嘧啶的雙鏈DNA（dU/dA堿基對）中催化釋放60 pmol尿嘧啶所需酶的量。
活性測定條件
Taq PCR Buffer：10 mM Tris-HCl (pH 8.3, 25°C)，20 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4，0.01% Tween 20，1.5 mM MgCl2 中，37℃溫育。
濃度：5U/μl
保存條件：-20℃可保存2年，避免反復凍融。
特點
? 活性測定buffer為Taq酶Buffer，與多種反應buffer兼容
? 雖然本酶高溫熱處理會失活，但降至低溫后活性會部分恢復
? 不建議本酶用于防止PCR 擴增產物的交叉污染。
應用
? 去除單鏈或雙鏈DNA中的尿嘧啶堿基
? 去除以前累積的PCR擴增的dU-DNA殘存污染
產品包裝規格及組成
Component | AE1101A | AE1101B |
EcUDG | 200U | 1kU |
10×UDG Buffer | 0.2ml | 1.0ml |
質量控制
經過嚴格的質控檢測，確保該產品具有最高的活性和純度。
酶保存液
20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 50% Glycerol, 0.1% (w/v) Triton X-100, pH 7.5。
相關產品
AE0101: Taq DNA Polymerase，AE1102 Thermolabile Uracil DNA glycosylase
應用舉例
防止PCR產物污染的使用方法
1. 按如下表格配制PCR反應液
PCR 組份 | 體積/μl | 終濃度 |
10×Taq 酶 Buffer | 5 | 1× |
dNTPs（2.0 mM） | 5 | 0.2 mM |
dUTP（2.0 mM） | 1-5 | 0.04-0.2 mM |
引物 F（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
引物 R（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
Template | 1-5 | / |
熱啟動 Taq 聚合酶（5U/μl） | 0.5 | 2.5U |
UDG（5U/μl） | 0.5 | 2.5U |
ddH2O | Variable | / |
總體積 | 50 | / |
2. 37℃下反應10分鐘，消除可能的dU-DNA污染物。
3. PCR反應。
警告: 本產品僅限科研實驗使用，臨床應用安全性和有效性未鑒定，不可用于醫療臨床診斷
注意事項
l Ec UDG具有較強的耐熱性，95℃保溫10分鐘可以失活95%酶活，但溫度降低至常溫，該酶會回復大部分活性。因此建議使用本公司的熱敏UDG酶，或者酚氯仿抽提去除EcUDG。
l UDG切割含dU堿基的ssDNA活性最高，大概是dU/dA雙鏈DNA的5-10倍，各種底物的活性順序為：dU/dA < dU/dG < dU/dC ≈ dU/dT < ssDNA。
l 常溫下可以用UDG抑制劑蛋白來抑制UDG的酶活性，但UDG抑制劑不耐高溫，高溫處理會失活UDG抑制劑，導致其不再抑制UDG的活性。
l UDG在較寬pH范圍均有活性，最優pH 8.0，不需二價陽離子，高于200 mM NaCl抑制活性。
l 大腸桿菌 UDG酶的反應溫度可以在 37-50℃ 的范圍內變化，建議在 37℃反應，也可根據實驗需要在 37-50℃范圍內自由調整反應溫度。
l UDG可以在 PCR反應前清除不慎污染的 U-DNA分子，對于某個DNA片段的 PCR擴增反應，整個操作室必須在所有操作批次的 PCR反應中添加 dUTP，使所有擴增產物都成為 U-DNA。如果僅某次 PCR擴增反應使用 dUTP，T-DNA仍積累，這個抗污染系統也難以起到完全的作用。
l UDG/dUTP系統是 PCR試劑專用的一種防污染措施，為了防止 PCR產物的污染，尤其是在臨檢實驗室中反復擴增同一片段時，必須嚴格規范實驗室的區域劃分和操作。
l 如果經過換房間、紫外照射、DNase消化等措施后，依然對某個片段存在污染，建議在不同的擴增區重新設計引物，以錯開污染片段。
