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產品說明
MMLV Reverse Transcriptase 來源于莫洛尼氏鼠白血病毒 (Moloney Murine Leukemia Virus, M-MLV)，具有依賴于 RNA 的 DNA 聚合酶活性、依賴于 DNA 的 DNA 聚合酶活性、缺失RNase H 活性。依賴于RNA 的 DNA 聚合酶活性能夠以RNA為模板鏈，合成互補的DNA鏈(cDNA)，該活性是反轉錄酶的主要活性； RNase H 活性能夠降解 DNA/RNA 雜合鏈中的 RNA，在 cDNA鏈合成反應中可能會降解RNA/DNA 雜合鏈中的模板 RNA，生成cDNA單鏈；依賴于 DNA 的 DNA 聚合酶活性能夠以cDNA單鏈作為模板，合成互補的雙鏈DNA。
本酶通過基因改造，缺失了 RNase H 活性，經重組表達獲得。RNase H 活性的缺失使得其合成cDNA 的長度和熱穩定性均比野生型 M-MLV 反轉錄酶有較大提高。本酶的反應溫度提升至45°C，仍具有較強活性，且延伸能力更強，可用于較長的 cDNA 合成。
活性定義
37°C 條件下，以 Poly(A) - Oligo(dT)為模板/引物，在 10 分鐘內，摻入 1 nmol 的[3H] dTTP 所需要的酶量定義為 1 個活性單位(U)。
濃度：200U/μl
保存條件：-20℃保存特點
? 無 RNase H 活性；
? 合成 cDNA 的長度優于野生型 M-MLV 反轉錄酶；
? 熱穩定性好：最適反應溫度為 37-45°C。適用范圍
? 第一鏈 cDNA 合成
? 全長 cDNA 合成，制備 cDNA 文庫；
? RT-PCR 以及 Real Time RT-PCR 反應。。產品包裝規格及組成
質量控制
相關測試表明無外源內切、外切脫氧核糖核酸酶污染。PCR 方法檢測無宿主殘余 DNA。酶貯存緩沖液
20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 200 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 0.01% Nonidet P40, and 50%
glycerol.
應用舉例 1 兩步法 RT-PCR
l 第一鏈 cDNA 合成實驗
若模板 RNA 是使用 RNA 提取試劑盒提取獲得，已經清除了殘留基因組 DNA，則可以直接進行以下步驟；否則請先去除 gDNA。
1. 將以下組分加入一個無核酸酶污染的 PCR 管中：
組份 | 體積/μl | 終濃度 |
Oligo(dT)20（50 μM） 或 Random Primers（25 μM） 或 Specific Primer（10 μM） | 1 | 5.0 μM 2.5 μM 1.0 μM |
RNA Template* | 1-5 | 100ng-1μg |
Nuclease-free Water | Up to 10 | / |
總體積 | 10 | / |
* Total RNA 的使用量一般為 10 ng～1 μg；mRNA 的使用量一般為 0.1ng～1 μg。
2. 將以上混合液在 65-70°C 下溫育 5-10 分鐘，迅速取出置于冰上冷卻 2-3 分鐘；
3. 繼續配制如下反應混合液：
組份 | 體積/μl | 終濃度 |
上述模板RNA/引物變性溶液 | 6 | / |
5×RT Buffer（含 DTT） | 4 | 1× |
dNTPs（10.0 mM） | 1 | 0.5 mM |
M-MLV RTase (H-) (200 U/μl) | 0.5 | |
RNase Inhibitor (40 U/μl) * | 1 | / |
Nuclease-free Water | Up to 20 | / |
總體積 | 20 | / |
*可選加，為了降低 RNaseA 污染可能導致的 RNA 降解，建議每個反應加1ul。
4. 手指輕柔敲彈混勻后，瞬時離心；
5. 若使用 Oligo(dT)20 或基因特異性引物，42°C 反應 30-60 分鐘；若使用隨機引物，首先 25°C
溫育 10 分鐘，之后 42°C 反應 30-60 分鐘；
6. 反應結束后，80℃保溫 1-5 分鐘失活 RTase，終止反應。然后冰上冷卻，用于后續實驗，或立即保存于-20°C。
得到的 cDNA 溶液可直接用于第二鏈cDNA 的合成或者 PCR 擴增等，PCR 擴增時 cDNA溶液的使用量建議使用 1-5 μl。
l PCR 擴增目標 cDNA 實驗
以上述第一鏈 cDNA 合成實驗中獲得的含有目標基因的 cDNA 為模板，進行 PCR 擴增。以下 PCR 反應舉例為 50 μl 標準 PCR 體系，僅供參考。實際 PCR 條件應根據模板、引物、目的片段大小加以優化，確定最佳反應條件。
按如下配方配制PCR混合液
組份 | 體積/μl | 終濃度 |
10×Taq Buffer | 5 | 1× |
dNTPs（2.0 mM） | 5 | 0.2 mM |
引物 F（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
引物R（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
上述 cDNA 溶液* | 1-4 | / |
Taq（2.5U/μl） | 1.0 | 2.5U |
ddH2O | up to 50 | / |
總體積 | 50 | / |
*50 μl PCR 體系 cDNA template 用量為 10ng-1μg。
PCR 反應條件
95℃ | 5 min | |
95℃ | 15 sec | |
55~72℃ | 20 sec | 30 Cycles |
72℃ | 1-2kb/min | |
72℃ | 1-5 min |
應用舉例 2 一步法 RT-PCR
一步法 RT-PCR 將 RNA 反轉錄合成 cDNA、目標 cDNA 的 PCR 反應合二為一。以下為一步法擴增標準體系（50 μl）。
組份 | 體積/μl | 終濃度 |
5×RT Buffer | 10 | 1× |
dNTPs（2.0 mM） | 5 | 0.2 mM |
引物 F（10 μM） | 2 | 0.3 μM |
引物R（10 μM） | 2 | 0.3 μM |
總 RNA* | X* | / |
Taq（2.5U/μl） | 1.0 | 2.5U |
M-MLV RTase (H-) (200 U/μl) | 0.5 | 100U |
RNase Inhibitor (40 U/μl) | 1 | 40U |
Nuclease-free ddH2O | Z ul | / |
總體積 | 50 | / |
* Total RNA 的使用量一般為 10 ng～1 μg；mRNA 的使用量一般為 1ng～1 μg
PCR 反應條件
42℃ | 30 min | |
95℃ | 3 min | |
95℃ | 15 sec |
|
55~72℃ | 20 sec | 30 Cycles |
72℃ | 1-2kb/min | |
72℃ | 3 min |
警告: 本產品僅限科研實驗使用，臨床應用安全性和有效性未鑒定，不可用于醫療臨床診斷。
注意事項
l 建議在冰上配置 PCR 反應液后，再放入 PCR 儀中進行擴增。這有利于提高擴增的特異性， 減少非特異性擴增，得到良好的 PCR 結果。
l 為了降低RNaseA 污染可能造成的 RNA 降解，導致 cDNA 合成失敗，強烈建議每個反應加 1μl RNase Inhibitor。
l RNA 相關實驗嚴格放置RNase A 污染，操作時需佩戴一次性口罩與手套，并及時更換。
l RNA 在堿性條件下不穩定，避免用高 pH 值溶液溶解 RNA。
