咨詢熱線：
400-660-9586
Component | AQ0113A | AQ0113B | AQ0113C | AQ0113D |
2×HSTaq-D UDG qPCR SuperMix （SYBR Green） | 1ml | 1ml×5 | 5ml×4 | 50ml |
50×Low ROX | 40μl | 200μl | 800μl | 1000μl×2 |
50×High ROX | 40μl | 200μl | 800μl | 1000μl×2 |
Nuclease-free Water | 1ml | 5ml | 20ml | 50ml |
產(chǎn)品說明：
2×HSTaq-D UDG qPCR SuperMix（SYBR Green）用于DNA的定量分析。本產(chǎn)品包含熱啟動型Taq-D DNA聚合酶、UDG、dNTPs、dUTP、SYBR Green和優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液，濃度為2×。qPCR 反應(yīng)時，只需加入模板、引物和水，使2×SuperMix溶液的濃度為1×即可進行反應(yīng)。樣本類型包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、cDNA等。熱啟動Taq-D DNA聚合酶為用抗體法修飾的改造型KlenTaq酶，無5’外切酶活性，因而具有特異性強、檢測靈敏度高等諸多優(yōu)點。Buffer專門針對qPCR進行了優(yōu)化，非常適合于進行高特異性、高靈敏度的qPCR檢測。UDG和dUTP的加入可以防止樣品的氣溶膠交叉污染。某些型號的qPCR儀需要ROX 參比染料。
? 減少qPCR操作時間。
? 避免因多步操作帶來的污染。
? DNA片段的定量 (≤3 kb)。
? 熱啟動Taq-D DNA 聚合酶，非特異性擴增導(dǎo)致的假陽性信號低
? PCR抑制劑耐受濃度高，可用于直擴型qPCR。特點：
擴增效率高、穩(wěn)定性好。適用范圍：
SYBR green 染料型qPCR擴增。
以下反應(yīng)舉例為 50 μl 標(biāo)準(zhǔn) qPCR 體系， 僅供參考。實際 qPCR 條件應(yīng)根據(jù)模板、引物、目的片段大小加以優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)條件。
1.在qPCR管中配制如下混合液
Component | Volume | Final Concentration |
2×HSTaq-D UDG qPCR SuperMix（SYBR Green） | 25μl | 1× |
Forward Primer（10μM） | 1.5μl | 0.3μM |
Reverse Primer（10μM） | 1.5μl | 0.3μM |
Template | Variable | as required |
dd H2O | Variable | - |
Total volume | 50μl | - |
反應(yīng)體系中各成分的量可根據(jù)以下原則自行調(diào)整：
l 有些q-PCR儀需要加入?yún)⒈热玖?/strong>ROX進行校正，參比染料使用請咨詢儀器生產(chǎn)商。
l 一般來說反應(yīng)體系中引物終濃度為0.2 μM即可得到較好的擴增效果。當(dāng)反應(yīng)性能比較差時，可以在終濃度0.1 - 1.0 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度。
l qPCR靈敏度極高，加入模板量的準(zhǔn)確程度對最終定量結(jié)果會有很大的影響。對于高濃度模板，推薦將模板稀釋10-100倍后加入反應(yīng)體系中，這樣可以有效提高實驗的準(zhǔn)確性。
2.按下列條件進行qPCR反應(yīng)
（1）常規(guī)擴增條件 （2）退火延伸一步法擴增條件
95℃ | 1 min | 預(yù)變性 |
95℃ | 5-10 sec | 循環(huán)擴增 30-40 Cycles |
50~60℃ | 15 sec | |
72℃ | 15 sec | |
72℃ | 1 min |
95℃ | 1 min | 預(yù)變性 |
95℃ | 5-10 sec | 循環(huán)擴增 30-40 Cycles |
60-68℃ | 30 sec | |
72℃ | 1min |
注意事項
l 本預(yù)變性條件適合絕大多數(shù)擴增反應(yīng)，如模板結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可將預(yù)變性時間延長至3 min，以提高預(yù)變性效果。
l 常規(guī)變性時間選擇10 sec；快速變性時間最短可選5 sec。
l 常規(guī)擴增條件的退火溫度可以根據(jù)引物的Tm值進行調(diào)整，當(dāng)Tm較高時可以提高退火溫度，增加擴增條帶的特異性。
l （1）常規(guī)擴增條件下，200-300 bp片段延伸時間72度15 sec，200 bp以內(nèi)片段72度10 sec；（2）退火延伸一步法擴增條件下，200-300 bp片段延伸時間60度30 sec；200 bp以內(nèi)片段延伸時間60度20 sec。
l 退火延伸一步法擴增條件下的引物Tm值需要高于延伸溫度3-5度。
l 儀器類型不同，融解曲線采集程序不盡相同，使用儀器默認融解曲線采集程序即可。
注意事項：
l 不適用于RNA的定量分析，RNA定量請使用本公司的SYBR Green型RT-qPCR 2×SuperMix（AQ0401系列）。
l 本品在4度避光保存3個月內(nèi)穩(wěn)定，盡量避免反復(fù)凍融，以免造成酶活下降。如每次使用量較少，推薦小份分裝使用。
l 使用前請上下顛倒以混勻Master Mix，短暫低速離心后即可使用。請勿vortex避免酶失活，影響定量結(jié)果。
l 加樣過程中輕柔吹打，如果操作不慎導(dǎo)致SuperMix起泡，需離心方可使用。
l 本品含有熒光染料SYBR Green I，需避光保存，配制反應(yīng)體系時應(yīng)盡量避免強光照射。
l 為了防止環(huán)境DNA的污染，反應(yīng)體系配制時請于超凈工作臺內(nèi)進行，配制過程中請使用滅菌槍頭、反應(yīng)管。
4 度保存 1 個月；-20℃保存 1 年。
