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Component | AQ0402A | AQ0402B | AQ0402C | AQ0402D |
一步法RT-qPCR 2×SuperMi（Taqman） | 1ml | 1ml×5 | 5ml×4 | 5ml×10 |
Nuclease free Water | 1ml | 5ml | 5ml×4 | 5ml×10 |
產品說明：
本產品一步法RT-qPCR 2×SuperMix（Taqman）用于RNA分子的定量分析，由于采用Taqman探針進行定量，消除了引物二聚體和非特異性擴增產物帶來的假陽性誤差。本產品包含MMLV RTase2.0、RNase Inhibitor、熱啟動型Taq DNA聚合酶、dNTPs和優化的反應緩沖液，濃度為2×。RT-qPCR 反應時，只需加入RNA模板、引物和DEPC處理水，使2×SuperMix溶液的濃度為1×即可進行反應。RNA分樣本類型包括總RNA、mRNA、核糖體RNA、tRNA等。核心組分之一MMLV RTase2.0經基因工程改造，熱穩定性顯著提高，可以耐受55-60度，使得反轉錄反應可以在50-55度進行，從而消除了RNA二級結構對反轉錄的抑制作用。Buffer專門針對RT-qPCR進行了優化，MMLV RTase和Taq DNA聚合酶在該Buffer中均有較高活性，且Taqman探針釋放信號高，非常適合于Taqman探針型一步法RT-qPCR。
特點：
? 一步法減少RT-qPCR操作時間。
? 避免因多步操作帶來的污染。
? RNA片段的定量 (≤3 kb)。
? 熱啟動Taq酶，非特異性擴增導致的假陽性信號低，擴增效率高、穩定性好。
? 采用Taqman探針進行定量，消除了引物二聚體和非特異性擴增產物帶來的假陽性。
? MMLV RTase2.0可以在50-55度反轉錄，從而消除了RNA二級結構對反轉錄的抑制作用。
適用范圍：
RNA樣品（mRNA、rRNA等）的RT-qPCR定量，Taqman探針型定量。
4度保存1個月；-20℃保存1年。
一步法 RT-PCR 將 RNA 反轉錄合成 cDNA、目標 cDNA 的 PCR 反應合二為一。以下反應舉例為 50 μl 標準一步法RT-PCR 體系， 僅供參考。實際 RT-PCR 條件應根據模板、引物、目的片段大小加以優化，確定最佳反應條件。
1.在無RNase A污染的PCR管中配制如下混合液
Component | Volume | Final Concentration |
RT-qPCR 2×SuperMix（Taqman） | 25μl | 1× |
Forward Primer（10μM） | 1.5μl | 0.3μM |
Reverse Primer（10μM） | 1.5μl | 0.3μM |
Taqman探針（10μM） | 0.5-1.0μl | 0.1-0.2μM |
RNA Template* | Variable | as required |
dd H2O | Variable | - |
Total volume | 50μl | - |
* Total RNA 的使用量一般為 10 ng～1 μg；mRNA 的使用量一般為 1ng～1 μg
反應體系中各成分的量可根據以下原則自行調整：
l Taqman探針的濃度一般在0.05-0.2μM，可能需根據擴增基因和探針的不同而進行濃度優化。
l 一般來說反應體系中引物終濃度為0.2 μM即可得到較好的擴增效果。當反應性能比較差時，可以在終濃度0.1 - 1.0 μM范圍內調整引物濃度。
2.按下列條件進行qPCR反應
（1）常規擴增條件
50℃ | 30min | 反轉錄 |
95℃ | 1 min | 預變性 |
95℃ | 5-10 sec | 循環擴增 30-40 Cycles |
50~60℃ | 15 sec | |
72℃ | 15 sec | |
72℃ | 1 min |
（2）退火延伸一步法擴增條件
50℃ | 30min | 反轉錄 |
95℃ | 1 min | 預變性 |
95℃ | 5-10 sec | 循環擴增 30-40 Cycles |
60-68℃ | 30 sec | |
72℃ | 1min |
注意事項
l 本反轉錄反應條件適合絕大多數RNA，如RNA模板結構復雜，可將反轉錄溫度提高到55度，以提高反轉錄效果。
l PCR階段常規變性時間選擇10 sec；快速變性時間最短可選5 sec。
l 常規擴增條件的退火溫度可以根據引物的Tm值進行調整，當Tm較高時可以提高退火溫度，增加擴增條帶的特異性。
l （1）常規擴增條件下，200-300 bp片段延伸時間72度15 sec，200 bp以內片段72度10 sec；（2）退火延伸一步法擴增條件下，200-300 bp片段延伸時間60度30 sec；200 bp以內片段延伸時間60度20 sec。
l 退火延伸一步法擴增條件下的引物Tm值需要高于延伸溫度3-5度。
儀器類型不同，融解曲線采集程序不盡相同，使用儀器默認融解曲線采集程序即可。
注意事項：
l 本品在4度避光保存1個月內穩定，盡量避免反復凍融，以免造成酶活下降。如每次使用量較少，推薦小份分裝使用。
l 使用前請上下顛倒以混勻Master Mix，短暫低速離心后即可使用。請勿vortex避免酶失活，影響定量結果。
l 加樣過程中輕柔吹打，如果操作不慎導致SuperMix起泡，需離心方可使用。
l 本品使用時額外加入的Taqman熒光探針需避光，因此配制反應體系時應盡量避免強光照射。
l 為了防止環境DNA的污染，反應體系配制時請于超凈工作臺內進行，配制過程中請使用滅菌槍頭、反應管。
l 由于本品檢測靈敏度極高，易被空氣中氣溶膠污染。因此如經常檢測某些特定基因，為了避免氣溶膠污染，建議使用本公司的 UDG型 Taqman探針型一步法RT-qPCR 2×SuperMix (AQ0412系列)
