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產品說明
Trt DNA 聚合酶是大腸桿菌重組表達的嗜熱細菌來源的熱穩定型DNA 聚合酶，分子量為94 kDa。本酶經特殊改造，具有很強擴增能力和延伸速度，擴增片段的長度可達 3-5 kb，延伸速度為 1 -2kb/ min（72℃）。該酶具有 5’→3’聚合酶活性，較弱的 5’→3’外切酶活；無 3’→5’外切酶活性。擴增產物具有 3'-dA 尾巴。另外在 Mn2+離子存在下，Trt DNA 聚合酶具有反轉錄活性，利用該特性， 可用該酶在同一管中進行反轉錄反應與 PCR 反應（1 步法 RT-PCR）。本規格包裝專門配備了含錳離子的反轉錄buffer體系。不過Trt DNA聚合酶的反轉錄酶活性明顯低于MMLV-RT，需要的RNA拷貝數較高，檢測靈敏度低于MMV-RT。本公司有較傳統MMLV-RT熱穩定性顯著提高的MMLV-RT2.0版本，可以在50-60度進行反轉錄反應。
以大馬哈魚精子 DNA 作為模板/引物，在 72℃、30 min 內，將 10 nmol 脫氧核糖核苷酸摻入到酸不溶物中所需的酶量，定義為一個活性單位（U）。
濃度：5U/μl
保存條件：-20℃保存特點
? 同時具有反轉錄酶活性與聚合酶活性，能夠用于 RNA 的一步法檢測；
? 熱穩定性好：95℃下半衰期超過 40 min；
? 耐受 dUTP，dITP；
? PCR 產物具有 3’-dA 尾巴，可直接用于 T/A 克隆。適用范圍
? 常規 PCR 擴增，菌落 PCR；
? 高溫反轉錄反應，降低RNA 二級結構對 RT 的影響；
? 一步法 RT-PCR。
Component | AE0301A/ AE0302A* | AE0301B/ AE0302B* | AE0301C/ AE0302C* | AE0301D/ AE0302D* |
Trt DNA polymerase | 250U | 250U×5 | 1250U×4 | 2500U×5 |
10×Trt PCR Buffer | 0.5 ml×1 | 1.0 ml×3 | 5.0 ml×2 | 5.0 ml×5 |
5×Trt RT-PCR Buffer# | 0.5 ml×1 | 1.0 ml×3 | 5.0 ml×2 | 5.0 ml×5 |
2 mM dNTPs | -/0.5 ml×1 | -/1.0 ml×3 | -/5.0 ml×2 | -/5.0 ml×5 |
*附帶 2mM dNTP 混合物。
#RT-PCR buffer 專門為 RT-PCR 配制，實驗需使用 DEPC 處理 ddH2O 和無核酸酶 A 試劑與耗材。質量控制
相關測試表明無外源內切或外切脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶污染；PCR 方法檢測無宿主殘余 DNA。
室溫放置一周，擴增活性無明顯改變；但強烈建議不要在室溫下長期放置，用畢放回-20 度。酶貯存緩沖液
10mM Tris-HCl (pH 7.5 at 25°C), 300mM KCl, 1mM DTT,0.1mM EDTA, 0.5mg/ml BSA and 50% glycerol.
應用舉例1. 常規 PCR
以下反應舉例為 50 μl 標準 PCR 體系， 僅供參考。實際 PCR 條件應根據模板、引物、目的片段大小加以優化，確定最佳反應條件。
PCR 組份 | 體積/μl | 終濃度 |
10×Trt PCR Buffer | 5 | 1× |
dNTPs（2.0 mM） | 5 | 0.2 mM |
引物 F（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
引物R（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
DNA Template | Varable* | / |
Trt（5U/μl） | 0.5 | 2.5U |
ddH2O | Varable | / |
總體積 | 50 | / |
*DNA template 可參照如下標準（50 μl PCR 體系）：
l 人類基因組 DNA | 0.1 μg-1 μg |
l λDNA | 0.5 ng-5 ng |
l 質粒 DNA | 0.01 ng-1 ng |
l 大腸桿菌 DNA | 10 ng-100 ng |
常規 PCR 反應條件
95℃ | 5 min | |
95℃ | 15 sec | |
55~72℃ | 20 sec | 30 Cycles |
72℃ | 1-2kb/min | |
72℃ | 3 min |
1. RT-PCR
以下反應舉例為 50 μl 標準 RT-PCR 體系，僅供參考。實際 RT-PCR 條件應根據 RNA 模板、引物、目的片段大小加以優化，確定最佳反應條件。
RT-PCR 組份 | 體積/μl | 終濃度 |
5×Trt RT-PCR Buffer | 10 | 1× |
dNTPs（2.0 mM） | 5 | 0.2 mM |
引物 F（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
引物R（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
RNA Template | Varable* | / |
Trt（5U/μl） | 1.5 | 7.5U |
ddH2O（DEPC 處理） | Varable | / |
總體積 | 50 | / |
80℃ | 2 min | |
55℃ | 10 min | |
95℃ | 5 min | |
95℃ | 30 sec |
|
55~72℃ | 30 sec | 30 Cycles |
72℃ | 1kb/min | |
72℃ | 3 min |
注意事項
l Trt DNA 聚合酶具有脫氧核苷酸轉移酶活性，因此在 PCR 產物 3’末端通常會加上 1 個多余的腺嘌呤。
l 建議在冰上配置 PCR 反應液后，再放入PCR 儀中進行擴增。這有利于提高擴增的特異性， 減少非特異性擴增，得到良好的PCR 結果。
l 如進行 PCR 擴增后，除目的條帶外，還伴隨其他雜帶，建議適當減少體系中的酶用量，以增加PCR 擴增反應的特異性。
l 本公司 10×PCR Buffer 經大量 PCR 反應實例優化而成，然而對某些 PCR 反應存在一個最優的鎂離子濃度。若需要優化鎂離子濃度，請購買本公司不含鎂離子的 buffer 和 MgCl2/MgSO4。
l 反轉錄酶活性需要 MnCl2 才能夠高效合成 cDNA，本公司 5×RT-PCR Buffer 經大量 RT-PCR 反應實例優化而成，然而對某些 RT 反應存在一個最優的錳離子濃度。若需要優化錳離子濃度，請購買本公司不含錳離子的 5×RT-PCR buffer 和 MnCl2/MnSO4。
警告: 本產品僅限科研實驗使用，臨床應用安全性和有效性未鑒定，不可用于醫療臨床診斷。
