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產(chǎn)品說明
Trt DNA聚合酶是大腸桿菌重組表達的嗜熱細菌來源的熱穩(wěn)定型DNA聚合酶，分子量為94 kDa。本酶經(jīng)特殊改造，具有很強擴增能力和延伸速度，擴增片段的長度可達3-5 kb，延伸速度為1 -2kb/ min（72℃）。該酶具有5’→3’聚合酶活性，較弱的5’→3’外切酶活；無3’→5’外切酶活性。擴增產(chǎn)物具有3'-dA尾巴。另外在Mn2+離子存在下，Trt DNA聚合酶具有反轉(zhuǎn)錄活性，利用該特性，可用該酶在同一管中進行反轉(zhuǎn)錄反應與PCR反應（1步法RT-PCR）。
活性定義
以大馬哈魚精子DNA作為模板/引物，在72℃、30 min內(nèi)，將10 nmol脫氧核糖核苷酸摻入到酸不溶物中所需的酶量，定義為一個活性單位（U）。
濃度：2.5U/μl
保存條件：-20℃保存
特點
? 同時具有反轉(zhuǎn)錄酶活性與聚合酶活性，能夠用于RNA的一步法檢測；
? 本酶經(jīng)特殊改造，具有很強擴增能力和延伸速度，可在2kb/ min延伸條件下，有效擴增3-5kb的DNA片段；
? 熱穩(wěn)定性好：95℃下半衰期超過40 min；
? 耐受dUTP，dITP；
? PCR產(chǎn)物具有3’-dA尾巴，可直接用于T/A克隆。
適用范圍
? 常規(guī)PCR擴增；
? 菌落PCR；
? TA克隆PCR產(chǎn)物添加3’-dA；
? 高溫反轉(zhuǎn)錄反應，降低RNA二級結(jié)構(gòu)對RT的影響；
? 一步法RT-PCR。
產(chǎn)品包裝規(guī)格及組成
Component | AE0181A/ AE0182A* | AE0181B/ AE0182B* | AE0181C/ AE0182C* | AE0181D/ AE0182D* |
Trt DNA polymerase | 100U | 500U | 500U×4 | 1000U×5 |
10×Trt PCR Buffer | 0.5 ml×1 | 1.0 ml×1 | 1.0 ml×4 | 1.0 ml×10 |
5×Trt RT-PCR Buffer# | 0.5 ml×1 | 1.0 ml×1 | 1.0 ml×4 | 1.0 ml×10 |
2 mM dNTPs | -/0.2 ml×1 | -/1.0 ml×1 | -/1.0 ml×4 | -/1.0 ml×10 |
*附帶2mM dNTP混合物。
#RT-PCR buffer專門為RT-PCR配制，實驗需使用DEPC處理ddH2O和無核酸酶A試劑與耗材。
質(zhì)量控制
相關測試表明無外源內(nèi)切酶或外切脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶污染；PCR方法檢測無宿主殘余DNA，能有效擴增人基因組中的單拷貝基因。
室溫放置一周，擴增活性無明顯改變；但強烈建議不要在室溫下長期放置，用畢放回-20度。
酶貯存緩沖液
10mM Tris-HCl (pH 7.5 at 25°C), 300mM KCl, 1mM DTT,0.1mM EDTA, 0.5mg/ml BSA and 50% glycerol.
應用舉例
1．常規(guī)PCR
以下反應舉例為50 μl標準PCR體系， 僅供參考。實際PCR條件應根據(jù)模板、引物、目的片段大小加以優(yōu)化，確定最佳反應條件。
PCR組份 | 體積/μl | 終濃度 |
10×Trt PCR Buffer | 5 | 1× |
dNTPs（2.0 mM） | 5 | 0.2 mM |
引物F（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
引物R（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
DNA Template | Varable* | / |
Trt（2.5U/μl） | 1.0 | 2.5U |
ddH2O | Varable | / |
總體積 | 50 | / |
*DNA template可參照如下標準（50 μl PCR體系）：
l 人類基因組DNA | 0.1 μg-1 μg |
l λDNA | 0.5 ng-5 ng |
l 質(zhì)粒DNA | 0.01 ng-1 ng |
l 大腸桿菌DNA | 10 ng-100 ng |
常規(guī)PCR反應條件
95℃ | 5 min | |
95℃ |
| |
55~72℃ | 20 sec | 30 Cycles |
72℃ | 1-2kb/min | |
72℃ | 3 min |
2. RT-PCR
以下反應舉例為50 μl標準RT-PCR體系， 僅供參考。實際RT-PCR條件應根據(jù)RNA模板、引物、目的片段大小加以優(yōu)化，確定最佳反應條件。
RT-PCR組份 | 體積/μl | 終濃度 |
5×Trt RT-PCR Buffer | 10 | 1× |
dNTPs（2.0 mM） | 5 | 0.2 mM |
引物F（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
引物R（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
RNA Template | Varable* | / |
Trt（2.5U/μl） | 1.0 | 2.5U |
ddH2O（DEPC處理） | Varable | / |
總體積 | 50 | / |
RT-PCR反應條件
80℃ | 2 min | |
55℃ | 10 min | |
95℃ | 5 min | |
95℃ |
| |
55~72℃ | 30 sec | 30 Cycles |
72℃ | 1kb/min | |
72℃ | 3 min |
注意事項
l Trt DNA聚合酶具有脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性，因此在PCR產(chǎn)物3’末端通常會加上1個多余的腺嘌呤。
l 建議在冰上配置PCR 反應液后，再放入PCR儀中進行擴增。這有利于提高擴增的特異性，減少非特異性擴增，得到良好的PCR結(jié)果。
l 如進行PCR擴增后，除目的條帶外，還伴隨其他雜帶，建議適當減少體系中的酶用量，以增加PCR擴增反應的特異性。
l 本公司10×PCR Buffer經(jīng)大量PCR反應實例優(yōu)化而成，然而對某些PCR反應存在一個最優(yōu)的鎂離子濃度。若需要優(yōu)化鎂離子濃度，請購買本公司不含鎂離子的buffer和MgCl2/MgSO4。
l 反轉(zhuǎn)錄酶活性需要MnCl2才能夠高效合成cDNA，本公司5×RT-PCR Buffer經(jīng)大量RT-PCR反應實例優(yōu)化而成，然而對某些RT反應存在一個最優(yōu)的錳離子濃度。若需要優(yōu)化錳離子濃度，請購買本公司不含錳離子的5×RT-PCR buffer和MnCl2/MnSO4。
警告: 本產(chǎn)品僅限科研實驗使用，臨床應用安全性和有效性未鑒定，不可用于醫(yī)療臨床診斷。
