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產(chǎn)品說明
Tkd DNA聚合酶是大腸桿菌重組表達(dá)的嗜熱古細(xì)菌來源的熱穩(wěn)定型DNA聚合酶，分子量為90 KD。其保真性是普通Taq DNA聚合酶的60倍左右。本酶經(jīng)特殊改造，具有超強擴增能力和延伸速度，擴增片段的長度可達(dá)6-10 kb，延伸速度為2-3 kb/ min（72℃）。該酶具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性。擴增產(chǎn)物為平末端，不適合TA克隆。
活性定義
以大馬哈魚精子DNA作為模板/引物，在72℃、30 min內(nèi)，將10 nmol脫氧核糖核苷酸摻入到酸不溶物中所需的酶量，定義為一個活性單位（U）。
濃度：2U/μl
保存條件：-20℃保存
特點
? 本酶經(jīng)特殊改造，具有超強擴增能力和延伸速度，可在2kb/ min延伸條件下，有效擴增5-8kb的DNA片段；
? 熱穩(wěn)定性好：98℃下半衰期超過40 min；
? 保真性最高：保真性是Taq DNA聚合酶的60倍；
? 不耐受dUTP、dITP；
? PCR產(chǎn)物具有平滑末端，可直接用于平端克隆。
適用范圍
? 高保真性PCR擴增；
? 制備基因克隆或蛋白表達(dá)用的PCR產(chǎn)物；
? 平末端PCR克隆(去除3’突出端)；
? 位點特異性突變。
產(chǎn)品包裝規(guī)格及組成
Component | AE0221A/ AE0222A* | AE0221B/ AE0222B* | AE0221C/ AE0222C* | AE0221D/ AE0222D* |
Tkd DNA polymerase | 250U | 250U×5 | 1250U×4 | 2500U×5 |
10×Tkd Buffer | 0.5 ml×1 | 1.0 ml×3 | 5.0 ml×2 | 5.0 ml×5 |
2 mM dNTPs | -/0.5 ml×1 | -/1.0 ml×3 | -/5.0 ml×2 | -/5.0 ml×5 |
*附帶2mM dNTP混合物。
質(zhì)量控制
相關(guān)測試表明無外源內(nèi)切酶或外切脫氧核糖核酸酶污染。PCR方法檢測無宿主殘余DNA。
室溫放置一周，擴增活性無明顯改變；但強烈建議不要在室溫下長期放置，用畢放回-20度。
酶貯存緩沖液
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 100 mM KCl, 0.5% Nonidet P40, 0.5% Tween 20, and 50% glycerol.
應(yīng)用舉例
注：以下反應(yīng)舉例為50 μl標(biāo)準(zhǔn)PCR體系， 僅供參考。實際PCR條件應(yīng)根據(jù)模板、引物、目的片段大小加以優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)條件。
組份 | 體積/μl | 終濃度 |
10×Tkd Buffer | 5 | 1× |
dNTPs（2.0 mM） | 5 | 0.2 mM |
引物F（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
引物R（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
Template | Varable* | / |
Tkd（2U/μl） | 0.5 | 1U |
ddH2O | Varable | / |
總體積 | 50 | / |
*DNA template可參照如下標(biāo)準(zhǔn)（50 μl PCR體系）：
l 人類基因組DNA | 0.1 μg-1 μg |
l λDNA | 0.5 ng-5 ng |
l 質(zhì)粒DNA | 0.01 ng-1 ng |
l 大腸桿菌DNA | 10 ng-100 ng |
PCR反應(yīng)條件
98℃ | 3 min | |
98℃ |
| |
55~72℃ | 15 sec | 30 Cycles |
72℃ | 2-3kb/min | |
72℃ | 5 min |
注意事項
l Tkd DNA聚合酶具有很強的3’外切核酸酶活性，因此在PCR產(chǎn)物3’為平末端，不適合TA克隆。要進(jìn)行TA克隆需用Taq DNA聚合酶對PCR產(chǎn)物進(jìn)行加A處理。
l Tkd DNA聚合酶為高保真酶，忠實性是Taq DNA聚合酶的68倍。
l 建議在冰上配置PCR 反應(yīng)液后，再放入PCR儀中進(jìn)行擴增。這有利于提高擴增的特異性，減少非特異性擴增，得到良好的PCR結(jié)果。
l 如進(jìn)行PCR擴增后，除目的條帶外，還伴隨其他雜帶，建議適當(dāng)減少體系中的酶用量，以增加PCR擴增反應(yīng)的特異性。
l 本公司Buffer經(jīng)大量PCR反應(yīng)實例優(yōu)化而成，然而對某些PCR反應(yīng)存在一個最優(yōu)的鎂離子濃度。若需要優(yōu)化鎂離子濃度，請購買本公司不含鎂離子的buffer和MgCl2/MgSO4。
l 因該酶與含有尿嘧啶和次黃嘌呤的DNA模板結(jié)合后會抑制DNA聚合反應(yīng)，故dUTP、dITP和含有這些核苷酸的引物不能用于Tkd DNA聚合酶催化的PCR擴增。
警告: 本產(chǎn)品僅限科研實驗使用，臨床應(yīng)用安全性和有效性未鑒定，不可用于醫(yī)療臨床診斷。
注意事項
l Tkd DNA聚合酶具有很強的3’外切核酸酶活性，因此在PCR產(chǎn)物3’為平末端，不適合TA克隆。要進(jìn)行TA克隆需用Taq DNA聚合酶對PCR產(chǎn)物進(jìn)行加A處理。
l Tkd DNA聚合酶為高保真酶，忠實性是Taq DNA聚合酶的68倍。
l 建議在冰上配置PCR 反應(yīng)液后，再放入PCR儀中進(jìn)行擴增。這有利于提高擴增的特異性，減少非特異性擴增，得到良好的PCR結(jié)果。
l 如進(jìn)行PCR擴增后，除目的條帶外，還伴隨其他雜帶，建議適當(dāng)減少體系中的酶用量，以增加PCR擴增反應(yīng)的特異性。
l 本公司Buffer經(jīng)大量PCR反應(yīng)實例優(yōu)化而成，然而對某些PCR反應(yīng)存在一個最優(yōu)的鎂離子濃度。若需要優(yōu)化鎂離子濃度，請購買本公司不含鎂離子的buffer和MgCl2/MgSO4。
l 因該酶與含有尿嘧啶和次黃嘌呤的DNA模板結(jié)合后會抑制DNA聚合反應(yīng)，故dUTP、dITP和含有這些核苷酸的引物不能用于Tkd DNA聚合酶催化的PCR擴增。
警告: 本產(chǎn)品僅限科研實驗使用，臨床應(yīng)用安全性和有效性未鑒定，不可用于醫(yī)療臨床診斷。
