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產品說明
Pfu DNA 聚合酶是大腸桿菌重組表達的嗜熱古細菌 Pyrococcus furiosus 來源的熱穩定型 DNA 聚合酶，分子量為 90 KD。其保真性是普通 Taq DNA 聚合酶的 18 倍左右。本酶經特殊改造，具有超強擴增能力和延伸速度，擴增片段的長度可達 5-6 kb，延伸速度為 1 kb/ min（72℃）。該酶具有 5’→3’聚合酶活性和 3’→5’外切酶活性。擴增產物為平末端，不適合 TA 克隆。
以大馬哈魚精子 DNA 作為模板/引物，在 72℃、30 min 內，將 10 nmol 脫氧核糖核苷酸摻入到酸不溶物中所需的酶量，定義為一個活性單位（U）。
濃度：2U/μl
保存條件：-20℃保存特點
? 熱穩定性好：98℃下半衰期超過 40 min；
? 保真性最高：保真性是Taq DNA 聚合酶的 10 倍；
? 不耐受 dUTP、dITP；
? PCR 產物具有平滑末端，可直接用于平端克隆。適用范圍
? 高保真性PCR 擴增；
? 制備基因克隆或蛋白表達用的PCR 產物；
? 平末端 PCR 克隆(去除 3’突出端)；
? 位點特異性突變。產品包裝規格及組成
Component | AE0201A/ AE0202A* | AE0201B/ AE0202B* | AE0201C/ AE0202C* | AE0201D/ AE0202D* |
Pfu DNA polymerase | 250U | 250U×5 | 1250U×4 | 2500U×5 |
10×Pfu Buffer | 0.5 ml×1 | 1.0 ml×3 | 5.0 ml×2 | 5.0 ml×5 |
2 mM dNTPs | -/0.5 ml×1 | -/1.0 ml×3 | -/5.0 ml×2 | -/5.0 ml×5 |
*附帶 2mM dNTP 混合物。質量控制
相關測試表明無外源內切酶或外切脫氧核糖核酸酶污染。PCR 方法檢測無宿主殘余 DNA。
室溫放置一周，擴增活性無明顯改變；但強烈建議不要在室溫下長期放置，用畢放回-20 度。酶貯存緩沖液
20 mM Tris-HCl (pH 8.2), 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 100 mM KCl, 0.1% Nonidet P40, 0.1% Tween
20, and 50% glycerol.
注：以下反應舉例為 50 μl 標準PCR 體系， 僅供參考。實際 PCR 條件應根據模板、引物、目的片段大小加以優化，確定最佳反應條件。
組份 | 體積/μl | 終濃度 |
10×Pfu Buffer | 5 | 1× |
dNTPs（2.0 mM） | 5 | 0.2 mM |
引物 F（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
引物R（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
Template | Varable* | / |
Pfu（2U/μl） | 0.5 | 1U |
ddH2O | Varable | / |
總體積 | 50 | / |
*DNA template 可參照如下標準（50 μl PCR 體系）：
l 人類基因組 DNA | 0.1 μg-1 μg |
l λDNA | 0.5 ng-5 ng |
l 質粒 DNA | 0.01 ng-1 ng |
l 大腸桿菌 DNA | 10 ng-100 ng |
PCR 反應條件
95℃ | 5min | |
95℃ | 15sec |
|
55~72℃ | 20 sec | 30 Cycles |
72℃ | 1kb/min | |
72℃ | 5 min |
注意事項
l Pfu DNA 聚合酶具有很強的 3’外切核酸酶活性，因此在 PCR 產物 3’為平末端，不適合 TA
克隆。要進行 TA 克隆需用 Taq DNA 聚合酶對 PCR 產物進行加 A 處理。
l Pfu DNA 聚合酶為高保真酶，忠實性是 Taq DNA 聚合酶的 18 倍。
l 建議在冰上配置 PCR 反應液后，再放入PCR 儀中進行擴增。這有利于提高擴增的特異性， 減少非特異性擴增，得到良好的PCR 結果。
l 如進行 PCR 擴增后，除目的條帶外，還伴隨其他雜帶，建議適當減少體系中的酶用量，以增加PCR 擴增反應的特異性。
l 本公司 Buffer 經大量 PCR 反應實例優化而成，然而對某些PCR 反應存在一個最優的鎂離子濃度。若需要優化鎂離子濃度，請購買本公司不含鎂離子的 Buffer 和 MgCl2/MgSO4。
l 因該酶與含有尿嘧啶和次黃嘌呤的 DNA 模板結合后會抑制 DNA 聚合反應，故 dUTP、dITP
和含有這些核苷酸的引物不能用于 Pfu DNA 聚合酶催化的 PCR 擴增。
警告: 本產品僅限科研實驗使用，臨床應用安全性和有效性未鑒定，不可用于醫療臨床診斷。
