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產(chǎn)品說(shuō)明
Tth RNase H 特異性識(shí)別并切割RNA-DNA雜交體中RNA序列的磷酸二酯鍵，同時(shí)保持DNA序列完整。這種熱穩(wěn)定的核酸酶具有與大腸桿菌RNase H相同的酶學(xué)性質(zhì)，但在更高的溫度下具有活性，最適活性在60 -70°C。這些特性允許在需要更高的檢測(cè)溫度的應(yīng)用中使用。適合于cDNA第二鏈合成時(shí)除去 mRNA ；以及一步法RT-PCR中去除mRNA鏈，生成cDNA單鏈，提高cDNA與引物的配對(duì)效果，改善RT-PCR效果。
本公司Tth RNase H是重組表達(dá)，并經(jīng)多步純化制備的重組蛋白。
活性定義
1單位指在溫度為50℃，1× Tth RNase H 反應(yīng)緩沖體系的條件下，20min內(nèi)水解40 pmol熒光標(biāo)記的25 bp RNA-DNA雜交鏈成1 nmol核苷酸所需的酶量。
活性測(cè)定條件
50 mM Tris-HCl，75 mM KCl，3 mM MgCl2，10 mM DTT (pH 8.3 @ 25℃)， ≥50°C溫育。
濃度：10U/μl
保存條件：-20℃保存
特點(diǎn)
? 不消化單鏈RNA、單鏈或雙鏈DNA
? 高溫酶35-75℃都有活性，活性隨溫度升高而增加，推薦溫度為50-65℃
適用范圍
? cDNA第二鏈合成時(shí)除去 mRNA
? RT-PCR去除RNA/DNA雜合雙鏈的RNA鏈，提高PCR效果
? RT-LAMP、RT-RPA等恒溫?cái)U(kuò)增中去除RNA/DNA雜合鏈的RNA鏈，提高恒溫?cái)U(kuò)增效果
? 雜交到 Oligo(dT) 上的mRNA poly(A)尾的去除
? 高嚴(yán)謹(jǐn)度的RNA結(jié)構(gòu)圖譜制備和RNA 位點(diǎn)特異性切割
產(chǎn)品包裝規(guī)格及組成
Component | AE2352A | AE2352B |
Tth RNase H | 250U | 1250U |
10× Tth RNase H Buffer | 0.2ml | 1.0ml |
質(zhì)量控制
相關(guān)測(cè)試表明無(wú)外源內(nèi)切、外切脫氧核糖核酸酶、RNase污染。PCR方法檢測(cè)無(wú)宿主殘余DNA。
酶貯存緩沖液
50mM Tris-HCl，1 M NaCl，1 mM DTT ，0.1 mM EDTA ，0.1 mM Triton? X-100 ，50% Glycerol，pH 7.5@ 25°C。
應(yīng)用實(shí)例
1、RT-PCR去除RNA/DNA雜合雙鏈的RNA鏈
1）按下表配制反應(yīng)體系
反應(yīng)組分 | 體積/ul |
10× PCR Buffer | 5 |
Primer-F（10uM） | 2 |
Primer-R（10uM） | 2 |
dNTP（2mM） | 5 |
RT反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 | 100-200ng |
Tth RNase H | 1 |
Taq DNA聚合酶(5U/ul) | 0.5 |
H2O | Variable |
總體積 | 50 |
2) 65°C反應(yīng)5-10min；
3) PCR反應(yīng)。
4) 瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA，或進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)
2、cDNA第二鏈合成時(shí)除去 mRNA
1）按下表配制反應(yīng)體系
反應(yīng)組分 | 體積/ul |
10× Buffer | 5 |
Primer-F（10uM） | 2 |
dNTP（2mM） | 5 |
RT反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 | 100-200ng |
Tth RNase H | 1 |
Pfu DNA聚合酶(2U/ul) | 0.5 |
H2O | Variable |
總體積 | 50 |
2) 50-65°C反應(yīng)15-30min；
3) 瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA，或進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)
警告: 本產(chǎn)品僅限科研實(shí)驗(yàn)使用，臨床應(yīng)用安全性和有效性未鑒定，不可用于醫(yī)療臨床診斷。
注意事項(xiàng)
l RNase H活性不受核酸酶抑制劑蛋白的抑制
l 高溫酶，與PCR酶的反應(yīng)溫度兼容匹配
l 蛋白酶K處理或添加過(guò)量EDTA使其失活
